След 25 дни статична инкубация при 28°C, лаказа от *Pleurotus ostreatus* NRC620 показа най-висока активност в гъбичната културална среда. Оптималните стойности на pH и температура за този ензим бяха съответно 3,0 и 70°C. След 2 часа инкубация при 40°C и 50°C, ензимната активност се запази съответно 68,33% и 59,61%. След 2 часа инкубация в цитрат-фосфатен буфер (pH 7,0), ензимната активност остана 100%. Добавянето на 10 mM MgSO₄ и CuSO₄ увеличи ензимната активност съответно с приблизително 21% и 35%, докато NaCl, MnCl₂, KCl и CaCl₂ инхибираха ензимната активност. Използвайки ABTS като субстрат, кинетичните параметри (Km и Vmax) на лаказа от *Pleurotus ostreatus* NRC 620 бяха съответно 1,99 mM и 16 217 μmol min−1 L−1. Ензимната обработка на пробите от ябълков сок значително намали както pH, така и вискозитета, и това намаление корелира с увеличаване на времето за съхранение. Обработката с лаказа доведе до леко намаляване на общото фенолно съдържание на ябълков сок, но не се наблюдава намаляване на антиоксидантната активност.
През последните години изследователите се фокусират върху приложението на зелените биотехнологии в хранително-вкусовата промишленост. Лаказата е един от най-полезните ензими в хранително-вкусовата промишленост, намиращ приложение в области като преработка на сокове, печене, стабилизиране на вино и подобряване на органолептичните качества на хранителните продукти.1Много висши растения и микроорганизми отделят лаказа,2и гъби като деутеромицети, аскомицети и базидиомицети също могат да произвеждат лаказа.3Лаказа (EC 1.10.3.2) е синя оксидаза, която редуцира молекулярния кислород до вода, използвайки система, състояща се от три различни медни атома, като по този начин окислява различни фенолни съединения и ароматни амини. По време на производството на плодови и зеленчукови сокове, ензимното и неензимното покафеняване са критични проблеми.4Тъй като тези вещества влияят негативно на цвета, вкуса и аромата на сока, те трябва да бъдат отстранени.5
От всички плодове, ябълките са най-консумираните в световен мащаб и в Европейския съюз. През 2019 г. производството на ябълки е на трето място в световен мащаб, надхвърляйки 87 милиона тона.6Ябълките съдържат множество фенолни съединения, включително флавоноиди и фенолни киселини като кафеена киселина и хлорогенова киселина.7Тъй като ябълковият сок обикновено се консумира в бистра форма, приблизително 50% до 90% от фенолните компоненти се губят по време на процеса на филтриране.8Днес потребителите са склонни да избират минимално преработени продукти, като например мътен ябълков сок с високо съдържание на полифеноли. Поради високото си съдържание на феноли обаче, този вид ябълков сок е особено податлив на обезцветяване и потъмняване.9Различни технологии, включително методи за термична обработка като пастьоризация при 60–90°C, се използват за намаляване или предотвратяване на потъмняването на ябълковия сок.10Въпреки това, според изследване на Sauceda-Gálvez11Термичната обработка може да унищожи летливите химикали и да повлияе на органолептичните качества на ябълковия сок. Алтернативите на методите за термична обработка включват свръхкритичен въглероден диоксид, ултравиолетова радиация, ултразвук, високо хидростатично налягане или хомогенизиране под високо налягане.12Ефективността на тези технологии и добивът на подходящи плодови сокове зависят от използваните параметри и характеристиките на продукта. Широкото им приложение е ограничено от високите разходи, неблагоприятните ефекти върху качеството на някои хранителни продукти или неадекватната ензимна инактивация.13,14
Лаказата може да се използва за стабилизиране и избистряне на плодов сок.15Гьокмен и др.16Препоръчват използването на лаказа за избистряне на плодови сокове, тъй като тя ефективно премахва фенолните съединения, като ги превръща в полимери или олигомери, които лесно се отстраняват от всяка ултрафилтрационна мембрана, което позволява на ябълковия сок да поддържа стабилен цвят и бистрота до шест седмици при 50°C. Пречистената лаказа от *Trichoderma* беше имобилизирана върху алуминиеви перли и използвана за селективно отстраняване на съединения с неприятен вкус, причинени от микробно замърсяване на ябълков сок.17
Приблизително 80-90% от летливите компоненти на ябълковия сок са естери и алдехиди, които придават уникален аромат на сока.18Лаказа от *Trametes versicolor* беше обездвижена върху евтина подложка, изработена от естествени влакна от млади кокосови черупки за избистряне на ябълков сок.19Предишни проучвания са изследвали стабилизирането на ябълков сок (цвят и мътност), използвайки методи без ензими или имобилизация, или в комбинация с ултрафилтрация.5,19Въпреки това, ефектът на гъбичните лакази върху физикохимичните свойства на ябълковия сок по време на съхранение остава неясен. Следователно, целта на това проучване беше експериментално да се изследват промените във физикохимичните свойства, съдържанието на фенолни съединения и антиоксидантната активност на ябълковия сок след третиране с гъбични лакази и двуседмично съхранение в хладилник. Лаказите имат способността да окисляват фенолни съединения, което ги прави обещаващи за използване в различни промишлени процеси, включително избистряне на сок. Това проучване изследва лакази от *Pleurotus ostreatus* NRC 620, като се фокусира върху идеалните условия за тяхната активност и ефективност при избистряне на сок. Докато изследванията върху кладници (P. ostreatus NRC 620) все още са ограничени, предишни проучвания са изследвали ензими от различни гъбични източници, като Trametes versicolor и Ganoderma lucidum. Целта на това проучване беше да се оцени потенциалното приложение на този ензим в хранително-вкусовата промишленост и да се подчертаят неговите уникални свойства, по-специално идеалното му pH и температура.
2,2′-Азооксибис(3-етилбензотиазолин-6-сулфонова киселина) (ABTS) е закупен от Sigma-Aldrich (Канада). Всички останали реактиви са с аналитична чистота.
Центърът за събиране на микробни култури към Националния изследователски център получи известния щам NRC620 на кладница. След субкултивиране, този щам се съхранява върху наклонени картофено-декстрозни агарови плаки при 4°C. Методът за приготвяне на инокулума е следният: 10-дневен, напълно развит мицел се инокулира върху картофено-декстрозни агарови плаки и се инкубира при 28°C. След 10 дни три мицелни блока с диаметър 12 mm се изваждат от агаровата среда с помощта на стерилен метален перфоратор и се поставят в 250-милилитрови ерленмайерови колби с памучни тампони, съдържащи 50 mL стерилизирана хранителна среда (pH 5.0, както е описано по-рано от Othman et al.20). Културите бяха инкубирани при 28°C в продължение на 18 дни. След това културите бяха филтрирани през филтърна хартия Whatman No. 1, а полученият супернатант служи като източник на ензими.
Лаказната активност беше определена с помощта на ABTS като субстрат. Реакционната смес (2 mL) съдържаше 500 μL 0.3 mM ABTS (разтворен в 0.1 M натриев цитратен буфер, pH 4.5) и необходимото количество ензимна проба, разредена с дестилирана вода.21,22Като се има предвид, че лаказата може да окислява ABTS при стайна температура (28 °C ± 2), окислението на ABTS беше определено чрез измерване на увеличението на абсорбцията при 420 nm (ε420= 36 000 см-1 M -1) с помощта на UV спектрофотометър Agilent Carry-100. Една единица лаказна активност беше необходима за окисляване на 1 μmol ABTS в минута. Концентрацията на протеин беше определена по метода на Брадфорд, като като вътрешен контрол беше използван говежди серумен албумин.23,24
След получаване на ензима от щам NRC 620 на кладница, неговата активност беше измерена при различни интервали на култивиране в продължение на 25 дни при статични условия при 28°C.
За да се изследва влиянието на температурата върху лаказната активност, експериментите са проведени в температурния диапазон от 20 до 90 °C. Преди добавяне на ензима и започване на реакцията, буферът (0,1 М натриев цитрат, pH 4,5) и субстратът (ABTS) са смесени и инкубирани в продължение на 5 минути при различни температури. Термичната стабилност на ензима е оценена чрез инкубация в 0,05 М натриев фосфатен буфер (pH 7,0) съответно при 40, 50, 60 и 70 °C за 2 часа. Остатъчната активност след това е оценена с помощта на ABTS субстрата.
Влиянието на pH върху лаказната активност беше оценено с помощта на ABTS като субстрат в 0,1 M цитратно-фосфатни буфери с pH диапазон от 2,5 до 7,0. Ензимният разтвор беше инкубиран при 40°C в продължение на два часа в 0,1 M цитратен и Tris буфери (pH 3, 4, 6 и 7), за да се оцени pH стабилността. Остатъчната активност с ABTS като субстрат беше изчислена след инкубация.
Лаказата се инкубира в продължение на 10 минути в натриево-фосфатен буфер (0,05 M, pH 7,0), съдържащ различни метални йони (Mg2+, Cu2+, Co2+, Ca2+, Zn2+, K+, Na+ и Mn2+) при концентрации съответно 2,5 mM и 10 mM. След това се добавя субстратът (ABTS), за да се инициира реакцията, и се оценява относителната активност.
Окислението на ABTS от лаказа при различни концентрации (0,025–3 mM) беше измерено при pH 4,5, за да се определят кинетичните параметри (Vmax и Km). Кинетикатаконстантиот уравнението на Михаелис-Ментен бяха изчислени с помощта на графика на Лайнуивър-Бърк, която изобразява реципрочната стойност на скоростта на реакцията като функция на концентрацията на субстрата. Кинетичните константи бяха изчислени от графиката на Лайнуивър-Бърк, използвайки софтуера GraphPad Prism версия 6.01.
След щателно измиване на ябълките с чешмяна вода, те бяха разрязани наполовина и изцедени с помощта на напълно автоматична сокоизстисквачка за ябълки Braun MP80 (произведена в Германия). Сокът беше филтриран през четири слоя тензух. Към контролната група не бяха добавени ензими, докато 2,0% лаказа (най-ефективната тествана концентрация) беше добавена към прясно приготвен ябълков сок, който след това беше съхраняван при 4°C в продължение на две седмици.
Титруемата киселинност (TA) и pH бяха определени съгласно метода на Boulton et al.ал.27PH на всяка проба беше измерено с помощта на цифров pH-метър (JENWAY 3510 pH-метър). Титруемата киселинност (TA) беше изчислена на базата на ябълчена киселина, използвайки следната формула.
Където V и C са съответно обемът (mL) и концентрацията (0,1 mol/L) на разтвора на натриев хидроксид, използван в титруването. K е коефициентът на превръщане на ябълчената киселина, равен на 0,067, а W е масата (g) на ябълковия сок.
Общото количество разтворими твърди вещества (ДДС) съдържанието на всички проби от сок беше определено с помощта на джобен рефрактометър PAL-1 (ATAGO, Токио, Япония). След всяко измерване оптичната леща беше изплакната с дейонизирана вода и всяка проба от ябълков сок беше тествана три пъти. Стойността за всяка проба беше изчислена чрез осредняване на трите измервания. Средната стойност ± стандартно отклонение за всяка проба от ябълков сок също беше изчислена чрез осредняване на тези резултати.
Вискоеластичността на пробите от ябълков сок беше оценена с помощта на ротационен вискозиметър (RV, Rheotest 2, Германия). Пробата беше поставена във вътрешността на цилиндъра „S2“ на вискозиметъра. Видимият вискозитет беше представен чрез наклона на кривата на напрежението на срязване спрямо скоростта на срязване, която беше изчислена от напрежението на срязване и съответните криви при различни скорости на срязване (от 1,00 до 437,4 s⁻¹). Формулата за изчисляване на видимия вискозитет е следната:
Където η е привидният вискозитет (cP), τ е напрежението на срязване (dyn/cm²), γ е скоростта на срязване (sec⁻¹) и (τ) се изчислява с помощта на стойностите на въртящия момент (α) и цилиндъра (Z), като се използва следната формула: τ = Z . α.
Индексът на покафеняване е определен съгласно метода на Meidav etал.2910-милилитрова проба от сок се центрофугира при 2750 x g за 10 минути. 5 ml от супернатантата на сока се смесват с 5 ml 95% етанол. Абсорбцията на сместа се измерва при 420 nm с помощта на UV спектрофотометър Shimadzu (UV-1601 PC).
Общото фенолно съдържание (TPC) беше определено колориметрично, използвайки реактива Folin-Ciocalteu, както е описано от Boulton et al.[27]]. Стандартна крива на галова киселина е построена за концентрации от 0 до 500 mg/L (r²= 0,997). Резултатите са изразени като еквиваленти на галова киселина (mg GAE/mL).
Добавете 125 μL дестилирана вода и 2850 μL разтвор на FRAP към 25 μL ябълков сок и оставете сместа на тъмно за30мин. След това измерете абсорбцията при 593 nm, използвайки UV спектрофотометър Shimadzu (UV-1601 PC). FRAP реагентът е приготвен чрез смесване на 300 mM ацетатен буфер (pH 3.6), 20 mM железен(III) хлорид и 10 mM 2,4,6-трис(2-пиридил)триазин (TPTZ) (разтворен в 40 mM HCl) в съотношение 10:1:1. Стандартна крива е генерирана, използвайки Trolox като стандарт (R²= 0,999), а резултатите са изразени като μM Trolox/mL.
Антиоксидантната активност на третираните и нетретираните сокове беше определена с помощта на DPPH метода, за да се оцени способността им да улавят DPPH свободните радикали.31Десет микролитра сок бяха смесени с 1 ml разтвор на DPPH (100 μM) в метанол. След реакция на тъмно в продължение на 30 минути, абсорбцията на сместа беше измерена при 517 nm с помощта на UV спектрофотометър Shimadzu (UV-1601 PC). Резултатите бяха изразени като еквиваленти на тролокс (μM тролокс/ml) въз основа на калибрационна крива (R2= 0,990).
Получените данни показват, че максимално производство на лаказа е наблюдавано в кладници NRC 620 до края на 18-ия ден от ферментацията, достигайки активност от 1302 U/L. Това послужи като основа за определяне на оптималното време за култивиране за производство на лаказа (Фигура 1). Въпреки че производството на ензими се увеличава с увеличаване на времето за култивиране, скоростта на увеличение не е пряко пропорционална на времето за култивиране; след 21 дни ензимната активност се е увеличила само с 90 U/L (до 1390 U/L). Следователно, 18 дни са избрани като оптимално време за култивиране, за да се балансира добива на продукта с икономическите ползи от увеличеното време за култивиране.
Влияние на времето за култивиране върху добива на лаказа в Pleurotus ostreatus NRC 620. Три (12 mm) гъбични мицелни блока бяха инокулирани в 50 ml стерилна среда и след това култивирани при 28 °C за различно време.
В съответствие с други проучвания, нашите резултати показват, че идеалният период на култивиране за постигане на пикова секреция на лаказа от гъбичките вероятно е между 7 и 36 дни.32Според Езике и др.33, *Trametes polyzona* WRF03 произвежда най-голямо количество лаказа до края на деветия ден от ферментацията, със специфична активност от 1637 U/mg протеин. Освен това, Othman et al.34установиха, че *Trichoderma harzianum* S7113 секретира голямо количество лаказа на петия ден от култивирането. Скоростта на производство на лаказа достига пикова активност на четиринадесетия ден и след това постепенно намалява.34Въпреки че секрецията на ензими може да се случи и по време на основната фаза на растеж, тя обикновено достига пик по време на междинната фаза и се задейства от консумацията на източник на въглерод или азот.34,35
Въпреки че лаказата от Pleurotus ostreatus NRC 620 показва висока активност в широк температурен диапазон от 50°C до 80°C, близо до пикова активност (69–98%), максималната ѝ активност се наблюдава при 70°C (фиг. 2а). Извън този температурен диапазон, ензимната активност намалява при приблизително 70°C. Тези резултати показват, че ензимът е активен при високи температури, вероятно защото високата температура увеличава кинетичната енергия на реакцията.
Влияние на реакционната температура (a) и pH (b) върху лаказната активност в *Pleurotus ostreatus* NRC 620. Температури в диапазона от 20 до 90 °C бяха постигнати чрез предварително инкубиране на сместа при различни температури в продължение на 5 минути преди добавяне на ензима и започване на реакцията. Влиянието на pH върху лаказната активност беше оценено с помощта на ABTS като субстрат в разтвори, съдържащи 0,1 M цитратно-фосфатен буфер в диапазон на pH от 2,5 до 7,0.
Според Езике и др.ал.33Оптималната температура за *Trametes polyzona* WRF03 лаказа е 55 °C, което е същото като това за *Ganoderma lucidum*.лаказ36и подобна на оптималната температура (50 °C) за *Trametes polyzona* KU-RNW02737лаказа . Балдриан38отбелязва, че както и за други ензимни системи, разграждащи лигнин, идеалният температурен диапазон за лаказа е между 50 и 70 °C.
Резултатите показват, че ензимът проявява най-висока активност при pH 3,0, достигайки 94% активност при pH 3,5. Въпреки това, той остава активен в широк диапазон на pH от 2,5 до 7,0 (Фигура 2b). Освен това, той проявява по-висока активност в киселинни условия в сравнение с неутрални или алкални условия. Активността му остава най-малко 77% в диапазона на pH от 2,5 до 4,5, но достига само приблизително 38% при pH 7,0. Оптималното pH за лаказа от *Trametes polyzona* WRF03 е 4,533, което е същото като pH за лакази от *Trametes polyzona* KU-RNW02737, *Trichoderma harzanium* 39, *Pleurotus* sp. 40 и *Trametes hirsuta* 41. Въпреки това, според проучването на Chairin et al.42, оптималното pH за лаказа от *Polymorpha f. sp.* WR710-1 е 2.2, докато оптималното pH за лаказа от *Polymorpha f. sp.* IBL-04 е 5.043. Свързването на хидроксидни аниони (инхибитор на лаказа) с медните атоми на T2/T3 лаказата може да е причината за намалената активност на лаказата при неутрални или алкални pH условия. Това може да наруши вътрешния електронен трансфер от T1 центъра към T2/T3 центъра, като по този начин...ограничаванеензимната активност23,44
Чрез инкубиране на ензима при различни температури беше установено, че както времето на инкубация, така и температурата влияят върху стабилността на ензима. Забележително е, че лаказа от *Trametes polyzona* NRC 620 показва по-висока стабилност при 40℃ и 50℃, запазвайки съответно 68,33% и 59,61% от началната си активност след 120 минути (Фигура 3а). За разлика от това, при същите условия (40℃ и 50℃, 120 минути), лаказа от *Trametes polyzona* WRF03 запазва съответно 64,38% и 42,92% от активността си.33Напротив, увеличаването на времето за инкубация и температурата намалява стабилността на лаказа от *Trametes polyzona* NRC 620; След инкубация при 60℃ и 70℃ в продължение на 60 минути, активността ѝ намалява съответно до 39,24% и 1,72% (Фигура 3а). В съответствие с експерименталните резултати, лаказа от *Trametes polyzona* WRF03 показва по-висока стабилност при 40 и 50℃ по време на целия процес на термична обработка.33По подобен начин, Луангджароенкит и др.ал.37и председател и др.ал.42съобщават за стабилността на лакази от Trametes polyzona KURNW027 и Trametes polyzona WR710-1 при 50 °C за 1 час, съответно. Като полезен биокатализатор, приложим в различни биотехнологични области, лаказата трябва да има добра стабилност и производителност в широк температурен диапазон.
Термостатична стабилност (a) и pH стабилност (b) на лаказа от *Pleurotus ostreatus* NRC 620. Термостатичната стабилност беше оценена чрез инкубиране на ензимния разтвор в 0,05 M натриев фосфатен буфер (pH 7,0) при 40, 50, 60 и 70°C за 2 часа, съответно. pH стабилността беше оценена чрез инкубиране на ензимния разтвор в 0,1 M цитратен буфер и Tris буфер (pH 3, 4, 6 и 7) при 40°C за 2 часа. Остатъчната активност беше изчислена с помощта на ABTS като субстрат след инкубация.
За да определим оптималните условия за използване и съхранение на ензима, изследвахме влиянието на pH върху стабилността на лаказата. Излагането на различни стойности на pH значително повлиява стабилността на протеиновата структура, като по този начин влияе върху стабилността и активността на ензимната молекула. Резултатите показват, че ензимът е по-малко стабилен при киселинни условия, докато демонстрира по-добра стабилност при по-високи стойности на pH (неутрални и алкални области). При стойности на pH от 7.0, 6.0, 4.0 и 3.0, степента на задържане на ензима след 120 минути е съответно приблизително 100%, 62.54%, 52.39% и 11.14% (фиг. 3б). Лаказата *Strombus multisus* WRF03 показва по-висока стабилност при неутрални стойности на pH (5.5–6.5) и по-ниска стабилност при киселинни стойности на pH (под 4.0). След 120 минути при pH стойности 5,5, 6,0 и 6,5, степента на задържане на ензимите е била съответно приблизително 82%, 100% и 93%.33Хайрин и др.42отбелязват, че лаказата от Trametes polyzona WR710-1 е стабилна в диапазона на pH от 6,0 до 7,0, докато Sayed et al.45показват, че лаказата е по-стабилна при неутрални pH условия. Лаказата от Cerrena unicolor обаче показва стабилност и при алкални условия (pH 9,0).46Изследваните лакази показват висока стабилност в широк диапазон на pH. Това може да е важна характеристика за промишлени приложения.
Тъй като някои метални йони имат както стимулиращи, така и инхибиторни ефекти върху ензимната активност, тяхното въздействие върху ензимната активност трябва да се вземе предвид в промишлените приложения. Това е от решаващо значение, тъй като металните йони са често срещани замърсители на околната среда, които могат да повлияят на стабилността и синтеза на извънклетъчните ензими.47За да изследваме ефектите на множество метални йони върху лаказа от *Pleurotus ostreatus* NRC 620, проведохме съответните експерименти. Както е показано на Фигура 4, в зависимост от вида на използвания метал, увеличаването на концентрацията на метални йони от 2,5 mM до 10 mM е повлияло отрицателно на ензимната функция. Например,Mg²⁺ , Co²⁺ , Zn²⁺иCu²⁺може да стимулира и активира ензимната активност, докатоНа⁺ , Мн²⁺ , Ca²⁺иК⁺може да инхибира ензимната активност. При концентрация от 10 mM, Cu²⁺ и Mg²⁺ йони са най-мощните активатори на лаказната активност от *Pleurotus ostreatus* NRC 620, осигурявайки степен на активиране съответно приблизително 34% и 20%. Въпреки това, при концентрация от 10 mM, Ca²⁺ йони са най-мощният инхибитор на лаказата, намалявайки ензимната активност с приблизително 60%.
Влиянието на металните йони върху активността на лаказата Pleurotus ostreatus NRC 620. Лаказата се инкубира в продължение на 10 минути в натриев фосфатен буфер (0,05 M, pH 7,0), съдържащ различни метални йони в концентрации от 2,5 mM и 10 mM. Реакцията се инициира чрез добавяне на субстрата (ABTS), след което се измерва относителната активност.
Нашите резултати са в съответствие с тези на други автори, които са установили, че Mg²⁺ и Cu²⁺ усилват активността на *Trametes polyzona* WRF03³. Castaño et al.⁴⁸ са установили, че лаказа от *Xylaria* sp. се стимулира до известна степен от медни йони (Cu²⁺). Освен това, Foroutanfar et al.⁴⁹ и Si et al.⁵⁰ са провели подобни изследвания върху лакази съответно от *Paraconiothyrium variabile* и *Trametes pubescens*. Мястото за свързване на мед тип II (T2) на този ензим може да бъде наситено с Cu²⁺ при дадена концентрация, което може да обясни стимулирането на лаказната активност при по-високи концентрации на Cu²⁺³⁹. Тъй като лаказите на гъбичките, причиняващи бяло гниене, са оксидази, съдържащи множество медни атоми, ефектите на медните йони върху лаказната активност са разнообразни и варират от стимулиращи и инхибиторни до неутрални.⁵¹ За разлика от това, Zhou et al.[52]съобщи, чеCu²⁺инхибира лаказната активност на тайванския подземен термит (Odontotermes formosanus). Лаказите на Cerena sp. HYB07 обаче[53]и Clitocybe maxima[54]не са били засегнати от медни йони.
Специфичността на субстрата беше представена чрез неговите кинетични параметри (Km и Vmax); колкото по-силен е афинитетът на свързване на субстрата с ензима, толкова по-ниска е стойността на Km и по-висока е специфичността на субстрата.3,21,55Кинетичните параметри (Km и Vmax) на лаказа от *Pleurotus ostreatus* NRC 620 бяха определени с помощта на софтуера GraphPad Prism 6.0 чрез нанасяне на графиката Lineweaver-Burk (Фигура 5). При използване на ABTS като субстрат, резултатите бяха 1,99 mM и 16217 μmol.мин⁻¹ Л⁻¹,съответно. Елсайед и др.21съобщават, че стойностите на Km за окисление на ABTS са съответно 0,1 mM и 0,064 mM, което показва висок афинитет на изоензимите Lac A и Lac B към ABTS. Освен това, стойностите на Vmax са 0,182 μmolмин⁻¹и 0,603 μmolмин⁻¹, съответно. Получената стойност на Km е по-ниска от тази на Trametes polyzona WRF03 (8,66 mM); освен това, тяхната стойност на Vmax (1429 mmol min⁻¹) също епо-нискапри използване на ABTS като субстрат.33 По подобен начин, стойностите на Km на концентрациите на лаказа в Lentinus squarrosulus MR13 и Trametes sp. AH28-2 бяха съответно 0,0714 mM и 0,025 mM, а стойностите на Vmax биха 0,0091 mM min−1 и 0,67 mM min−1 mg−1 (спрямо ABTS).съответно.56,57
Изследван е ефектът от концентрацията на ABTS върху активността на лаказа от *Pleurotus ostreatus* NRC 620 и е построена графика на Lineweaver-Burk на реципрочната стойност на началната скорост на реакцията спрямо концентрацията на ABTS. Окислителната реакция на ABTS с различни концентрации (0,025–3,0 mM) лаказа е измерена при pH 4,5, за да се определят кинетичните параметри (Vmax и Km). Кинетичните константи на Michaelis-Menten са изчислени с помощта на графиката на Lineweaver-Burk на реципрочната стойност на скоростта на реакцията спрямо концентрацията на субстрата. Кинетичните константи са изчислени от графиката на Lineweaver-Burk, използвайки софтуера GraphPad Prism 6.01.
Традиционните ензими за избистряне, като пектиназите, хидролизират пектинови вещества, намалявайки вискозитета и мътността. Те ефективно разграждат структурните полизахариди и често се използват в комбинация с други ензими, като целулази и хемицелулази, за подобряване на добива и бистротата. Пектиназите обаче не са насочени специално към фенолните съединения, които са основните причинители на мътността и окислителното покафеняване, особено в сокове като ябълков и гроздов сок.58За разлика от това, лаказите катализират окислението на фенолните съединения, полимеризирайки ги в по-големи, неразтворими молекули, които могат да бъдат отстранени чрез утаяване или филтриране. Този механизъм не само подобрява бистротата, но и удължава срока на годност на сока, като намалява вероятността от окислително покафеняване, причинено от фенолни съединения. Освен това, процесите на избистряне на базата на лакази могат да се извършват при меки условия на обработка (pH 3,5–5,5, температура 25–40 °C), което ги прави подходящи за деликатни сокове, без да се компрометират техните хранителни или органолептични свойства.59Проучванията показват, че третирането с пектиназа може да избистри сока за 1-2 часа, докато третирането с лаказа обикновено изисква по-дълго време за реакция (3-6 часа), за да се редуцират напълно фенолните съединения. Този процес обаче може да бъде оптимизиран чрез обездвижване на ензима или чрез комбиниране на лаказа с механични методи за избистряне.60В това проучване, ензимното профилиране на суровия екстракт разкри значителна лаказа и α-амилазна активност, докато пектиназната и ксиланазната активност бяха изключително ниски, а целулазната активност не беше открита. Следователно, намаляването на мътността и фенолното съдържание се дължи главно на действието на лаказа, докато промяната във вискозитета може да се дължи отчасти на действието на амилазата.
Таблица 1 показва физикохимичните параметри на прясно изцеден ябълков сок и проби, третирани с лаказа. Резултатите показват, че добивът на прясно изцеден ябълков сок (71,59%) е по-нисък от този на пробите, третирани с лаказа (87,34%). Тези резултати са в съответствие с констатациите на Пилник и Оранж.61, който посочи, че използването на ензими при преработката на плодове може да увеличи добива на сок, да подобри филтрацията и да получи висококачествен, бистър сок за концентриране. Увеличението на добива на сок се дължи главно на увеличаването на съдържанието на разтворими захари в сока. По време на ензимната хидролиза на плодовете, мезоглеята и пектинът в клетъчните стени на продукта се разрушават и се превръщат в разтворими вещества като неутрални захари и киселини.62.Стойността на pH на ензимно третирания ябълков сок е значително по-ниска от тази на контролната група (P < 0,05), а стойността на pH и на двете групи се е увеличила значително по време на съхранение (Таблица 1). Тези резултати са в съответствие с тези на Mark et al.63, който отбеляза, че pH на сока от кашу намалява след съхранение след термична обработка. Разграждането на пектина и образуването на галактуронова киселина след ензимна обработка може да са причина за повишаването на pH по време на съхранение. pH на ензимно третираните проби остава между 4,05 и 4,31 по време на съхранение, докато pH на нетретирания ябълков сок варира между 4,12 и 4,33.
Общата киселинност (TA) както на нетретираните, така и на третираните с лаказа проби показва тенденция на намаляване с увеличаване на времето на съхранение (Таблица 1). Намаляването на киселинността се дължи на превръщането на органичните киселини във въглехидрати или ензимни реакции, както и на окислението по време на съхранение на сока.64Общата киселинност на контролния ябълков сок и ензимно третираните проби е по-ниска от тази на други сокове (сок от ягоди 0,9%, сок от сливи 2,2%, сок от кумкуат 1,0%, сок от кайсии 2,4%, портокалов сок 0,8%), но подобна на тази на други сокове (напр. сок от круши 0,3%).62Тези разлики в нетретирания прясно изцеден ябълков сок могат да се дължат на различни фактори, като условия на отглеждане, генетични фактори, ниво на зрялост и методи на обработка.65Намаляването на общата киселинност на контролния и обработения с лаказа ябълков сок е в съответствие с резултатите, представени от Singh et al.66относно намаляването на общата киселинност на ябълковия сок Jin Nuo след 74 дни съхранение. От друга страна, Ошмянски и Войдило67не откриха значителни промени в киселинността на ябълковия сок при изследване на ефекта от традиционните методи за избистряне.
Резултатите, представени в Таблица 1, показват, че стойността на общото съдържание на разтворими твърди вещества (TSS) в обработения с лаказа ябълков сок е по-висока от тази на нетретираната проба. Тези резултати са в съответствие с публикуваните проучвания.68Освен това, Таблица 1 показва, че стойността на общата сумарна сумарна стойност (TSS) на контролната група с ябълков сок е била 9,58 в началния момент и е достигнала 11,05 до края на периода на съхранение. Тези стойности са по-ниски от стойностите на TSS на пресен ябълков сок, докладвани от Хамид и др.69(съответно 11,2 и 11,80). Стойността на общото количество разтворими вещества (TSS) на пробите от ябълков сок, третирани с лаказа, се е увеличила значително, започвайки от 11,23 и достигайки 12,93 след две седмици съхранение при 4°C (Таблица 1). Подобно увеличение на TSS по време на съхранение е наблюдавано и при цитрусови плодове, лимони и сладки портокали. Увеличението на общото количество разтворими вещества (TSS) по време на съхранение може да се дължи на хидролизата на полизахариди (нишесте) до монозахариди (захари), увеличаването на концентрацията поради дехидратация на сока и разграждането на пектина в сока до разтворими вещества. Увеличението на общото количество разтворими вещества (TSS) вероятно се дължи на увеличаването на разтворимите захари, които могат да се образуват чрез превръщането на пектин или целулоза в разтворими захари съответно от пектин или целулаза, или чрез хидролизата на нишесте до захари, както е съобщено от Hamed et al.69.Влиянието на лаказата върху свойствата на ябълковия сок може да се наблюдава визуално, тъй като обработеният с лаказа ябълков сок показва по-добра течливост и по-нисък вискозитет от нетретирания сок. Това наблюдение е записано в Таблица 1; Вискозитетът на третираната с ензим проба е 1,87 cP, докато вискозитетът на контролната проба е 2,95 cP. Това значително намаление на вискозитета вероятно се дължи на по-високия капацитет за задържане на вода на пектиноподобните вещества и образуването на кохезионна мрежова структура.
В това проучване е изследван ефектът на лаказата върху индекса на покафеняване (BI) на ябълков сок чрез измерване на абсорбцията при 420 nm с помощта на спектрофотометър. Резултатите са показани в Таблица 1. По време на съхранение, BI на пробите от ябълков сок както в третираната, така и в нетретираната група показва тенденция на постепенно нарастване. BI отразява степента на покафеняване и може да служи като...важениндикатор за ензимни и неензимни реакции на покафеняване. Абсорбцията се е увеличила значително по време на съхранение (P < 0,05). В края на съхранението,А420Стойността на пробите от ябълков сок в контролната и ензимно третираната група се е увеличила съответно с около 217% и 121% (Таблица 1). Резултатите показват, че ензимната обработка може ефективно да намали степента на покафеняване с около 56%. Резултатите на Bezerra et al.[19]] са в съответствие с нашите резултати; Те са използвали лаказа-глутаралдехид-кокосови влакна за избистряне на ябълков сок, намалявайки първоначалния му цвят с 61%.
Въпреки че полифенолите в плодовите сокове имат положителни хранителни и терапевтични ефекти върху човешкото тяло, те могат да реагират и с протеини, причинявайки помътняване, утаяване или мътност на сока, като по този начин променят вкуса и аромата на продукта и намаляват срока му на годност.71Целта на това проучване беше безопасно да се намали съдържанието на фенолни съединения в ябълковия сок, използвайки лаказа от Pleurotus ostreatus NRC 620. Резултатите, представени в Таблица 1, показват, че общото съдържание на фенолни съединения в ябълковия сок, третиран с лаказа, е значително намалено преди съхранение при 4°C. Освен това, общото съдържание на фенолни съединения също намалява по време на съхранение и в двете изследвани проби (Таблица 1). Изследване от Sandri et al.72показват, че ензимно обработеният ябълков сок може да запази своята антиоксидантна активност и съдържание на фенолни съединения. Резултатите от проучване на Lettera et al. обаче...73показват, че третирането на портокалов сок с гъбична лаказа може да намали съдържанието на фенолни съединения в него с до 45%.
Фенолните съединения са показали, че притежават свойства като улавяне на свободни радикали, редукция и гасене на синглетния кислород, пренос на водородни атоми и донорство на електрони на свободните радикали, което ги прави мощни антиоксиданти.74Следователно, в това проучване бяха използвани методи, базирани на DPPH и FRAP, за да се оцени ефектът на лаказа върху антиоксидантната активност на ябълков сок, съхраняван в хладилник в продължение на 14 дни (Таблица 2). И двата метода показаха повишаване на антиоксидантната активност по време на съхранение, което може да се дължи на увеличаването на свободните фенолни съединения или на образуването на продукти от реакцията на Майлар (MRP), като продуктите от реакцията на Майлар вероятно са причина за повишаването на антиоксидантната активност.75Неензимните реакции на покафеняване (включително разграждане на аскорбинова киселина, реакции на Майлар и киселинно катализирано разграждане на захари) произвеждат кафяви пигменти (меланоидини). Междинните продукти от разграждането на аскорбинова киселина и продуктите от разграждането на захари (като карбонилни съединения) могат да реагират с аминокиселини чрез реакции на Майлар.76Въпреки че покафеняването на плодове и зеленчуци по време на съхранение е обстойно проучено, разбирането ни за тези реакции остава ограничено.77В сравнение с метода FRAP, обработеният с лаказа ябълков сок показа значително по-ниска антиоксидантна активност по метода DPPH (Таблица 2), а антиоксидантната активност на всички проби се увеличи значително с увеличаване на времето на съхранение. В това проучване бяха използвани два различни метода за определяне на антиоксидантната активност, тъй като техните принципи се различават. Методът DPPH измерва способността за неутрализиране на свободните радикали, докато методът FRAP измерва способността за редуциране на железни йони. Поради това се препоръчва използването на множество методи за определяне на антиоксидантната активност, за да се разбере по-добре антиоксидантната активност на изследваните проби.78
Едно от ключовите открития на това проучване е, че лакказата NRC 620 от *Pleurotus ostreatus* проявява оптимална активност при 70°C и pH 3.0. В сравнение с други гъбични лакази, често използвани за избистряне на сокове, като лаказите от *Trametes versicolor* и *Ganoderma lucidum*, *P. ostreatus* NRC 620 проявява по-висока термична стабилност и по-киселинно pH. Лаказите от *Trametes versicolor* и *Ganoderma lucidum* обикновено проявяват оптимална активност в диапазона от 50-60°C и при pH стойности между 3.5 и 5.0. Тази разлика може да допринесе за подобрена ефективност на избистряне на сокове, особено за киселинни сокове, където стабилността при по-ниски pH стойности е от решаващо значение. Уникалната характеристика на *P. В сравнение с други изследвани гъбични лакази, *Pleurotus ostreatus* NRC 620 проявява способността да функционира ефективно при по-трудни условия. По-високата му оптимална температура на активност предполага потенциални предимства в промишлените приложения, като например по-бързи скорости на реакция и намалено микробно замърсяване. Ниското му pH, което е добре пригодено за киселинния характер на много сокове, може да бъде полезно в процесите на избистряне на сокове. Тези резултати оправдават по-нататъшни проучвания за мащабно приложение, което прави *Pleurotus ostreatus* NRC 620 жизнеспособна алтернатива на традиционните гъбични източници на лаказа. В сравнение с предишни проучвания, ние установихме, че оптималната температура е 60°C, а оптималното pH е 3,0. След реакция при 60°C в продължение на 80 минути, лаказа от *Ganoderma lucidum* се задържа...46% от неговата активност.79 Според Курниавати и Никел80Ензимите от *Ganoderma lucidum* показват отлична до умерена стабилност при 25°C и pH стойности в диапазона от 5,0 до 8,0, и стабилност при pH 6,0 и температури в диапазона от 10 до 30°C. В това проучване установихме, че оптималните pH и температура за ензимната активност на *Pleurotus ostreatus* са съответно 3,0 и 70°C. След инкубация при 40°C и 50°C в продължение на два часа, ензимът запазва съответно 68,33% и 59,61% от активността си. Освен това, лаказата на Pleurotus ostreatus NRC 620 показва висока активност в широк температурен диапазон от 50°C до 80°C, достигайки почти максимална активност (69%–98%), с максимална активност, наблюдавана при 70°C.
В заключение, лаказа NRC620 от кладница, получена при статични условия, демонстрира оптимална активност и стабилност в диапазон от pH и температурни условия, демонстрирайки превъзходна стабилност в сравнение с други ензимни източници. Добавянето на 10 mM MgSO₄ и CuSO₄ увеличи ензимната активност съответно с приблизително 21% и 35%. Когато се преработи в ябълков сок, ензимът намали pH и вискозитета, докато фенолното съдържание намаля само леко по време на съхранение.
Резултатите потвърждават потенциала на лакаса в хранително-вкусовата промишленост, особено при избистрянето на напитки. Чрез специфично разграждане на фенолните съединения, лакаса не само намалява мътността и подобрява бистротата, но и поддържа качеството на плодовите сокове при меки работни условия. За разлика от традиционните избистрящи агенти като желатин, бентонит и силикагел, лакаса не генерира отпадъци и не премахва приятни аромати от напитките, което я прави по-екологичен и устойчив вариант. Освен това, в сравнение с други ензими и методи за филтриране, лакаса предлага целенасочено и рентабилно решение, без да се прави компромис с качеството на продукта.
Кьомухимбо, Х.Д. и Бринк, Х.Г. Приложения и стратегии за обездвижване на мед-съдържащи лакази; преглед. Heliyon 9, e13156 (2023).
Време на публикуване: 15 декември 2025 г.